TINCIONES HEMATOLÓGICAS
La realización
de extensiones y tinciones es práctica habitual en el laboratorio. Pese a no
realizarse a todas las muestras, al no ser considerado procedimiento de rutina,
es necesario en aquellos casos en los que se detecte mediante análisis previos
alguna alteración....
La correcta
realización, así como una buena interpretación de lo observado, permite en
muchos casos el diagnóstico de hematopatías.
1. INTRODUCCIÓN.
Las tinciones
hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las
estructuras que componen las células sanguíneas. Esto tiene por objeto el
aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y
permite por tanto que las células sean visual izadas microscópicamente con
mayor facilidad.
2. TIPOS DE
TINCIONES.
Las tinciones
hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios:
·
Atendiendo al
nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se dividen en
tinciones vitales y no vitales.
·
Atendiendo al
momento en el que empezaron a ser utilizadas para el diagnóstico hematológico,
se dividen en tinciones tradicionales y especiales.
2.1. TINCIONES
VITALES Y NO VITALES.
Las tinciones
vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están
vivas.
Las tinciones
vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la
introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son
colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno.
Las tinciones
supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero
que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se
realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un
proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su
estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La
fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con
etanol o metanol.
2.2. TINCIONES
TRADICIONALES Y ESPECIALES.
Tradicionalmente,
las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia
derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clásicas). Estos colorantes se
reúnen en 4 grupos:
·
Colorantes
ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras
alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de
ellos es la eosina.
·
Colorantes
básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras
ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es
el azul de metileno.
·
Colorantes
neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados.
Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el
eosinato de azul de metileno.
·
Colorantes
indiferentes: son los que no tienen afinidad
por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas
sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado
para preparar la solución colorante. Uno de ellos es el Sudán III empleado para
teñir las grasas.
También hay
combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una
coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes
neutras y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes
neutras juntas.
El primero que
tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los
colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él
preparó.
Los colorantes
de tipo Romanowsky constan de un colorante ácido (eosina) y de colorantes básicos
(tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por
desmetilación oxidatiya (colorantes tipo azur).
Las tinciones
realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que más frecuentemente se emplean
en el diagnóstico hematológico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada
sola o en combinación con la de May-Grünwald).
También hay
tinciones panópticas rápidas que producen una coloración fácil y rápida de las
estructuras celulares. Las tinciones especiales sólo se usan en circunstancias
específicas. Son de dos clases:
·
Tinciones
fluorescentes: emplean colorantes
(fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por una
luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un color característico. Los
fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de
acridina y el rojo neutro.
·
Tinciones
citoquimicas: demuestran la presencia, más o menos abundante, o
la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los
gránulos citoplasmáticos de los leucocitos.
Sirven para
reconocer células leucocitarias (normales o anómalas) y, por tanto, para
diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante
preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia
de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de
unas células leucocitarias inmaduras a la línea granulocítica o a la
monocítica.
3. DENOMINACIÓN
DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS.
Atendiendo a sus
apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las
siguientes formas:
·
Estructuras
acidófllas u oxifilas: son aquellas
que fijan colorantes de naturaleza ácida.
Si el colorante
ácido que captan es la eosina, se dice que son eosinófilas. Con las tinciones tradicionales
adquieren un color rosado.
·
Estructuras
basófllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza
alcalina.
Con las
tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tiñen de lila o
púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófllas.
4. CAUSAS DE
ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUÍNEOS.
Si la tinción de
una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a:
·
Un pH bajo del
colorante.
·
Un tiempo de
coloración insuficiente.
·
Un lavado
excesivamente prolongado.
·
Si la tinción es
demasiado azul, posiblemente, esto esté causado por: un grosor excesivo de la
extensión, o un pH alto del colorante.
·
Una coloración
excesivamente prolongada.
·
Un lavado
insuficiente.
Si tras la
tinción aparecen artefactos o/y precipitados en la extensión, probablemente
esto se deba a:
·
Un empleo de
portaobjetos sucios.
·
Una falta de
filtración del colorante.
·
Una coloración
excesivamente prolongada.
·
Un secado del
colorante durante la tinción.
·
Un lavado
insuficiente.
Muchos de estos
errores pueden obviarse utilizando teñidores automáticos de las extensiones
sanguíneas. Actualmente, no suelen emplearse en la práctica clínica.
5. TINCIÓN
GIEMSA.
Las tinciones
hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de
oxidación (azur A, azur B y azur C) como colorantes básicos, combinándolos con
la eosina como colorante ácido.
De este modo,
obtenemos una tinción diferencial, es decir, una tinción que es capaz de
discriminar entre las distintas estructuras celulares según se tiñan éstas con
el colorante ácido, con el básico o con la mezcla de ambos.
Según la
proporción de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante tendremos
distintos métodos de tinción. Entre ellos, los más conocidos son el método de
Giemsa, el de Wright, el de Leishman y el pan óptico de
Pappenheim.
Metódica
Es un extracto
de las técnicas de tinción hematológicas de la casa Panreac.
Fundamento
Utilizamos como
colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa.
Material
necesario
·
Microscopio
óptico.
·
Portas bien
limpios.
·
Cristalizador.
·
Puentes de
tinción.
·
Pipetas Pasteur
con chupete.
·
Frascos
lavadores.
·
Tubos de ensayo.
Reactivos
·
Colorante en
solución según Giemsa de Panreac.
·
Solución tampón
pH 7,2 de Panreac.
·
Metanol.
·
Aceite de
inmersión.
Muestra
Sangre capilar
fresca o venosa anticoagulada. El anticoagulante de elección es la heparina o
el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar
preparaciones defectuosas.
Técnica
·
Preparamos un
frotis sanguíneo según la técnica descrita con anterioridad.
·
Colocamos el
frotis sobre el puente de tinción, en el cristalizador y en posición
horizontal.
·
Cubrimos el
frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire.
Con esto procedemos a fijar el frotis.
·
Diluimos en un
tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de
solución tampón pH 7,2. Es importante realizar esta dilución en el momento de
la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para otro día.
·
Mezclamos
suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis con la
dilución de colorante, dejándolo actuar durante 25 minutos.
·
Escurrimos y
lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón pH 7,2 hasta eliminar
los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical.
Lectura de
resultados
Una vez seca la
tinción, echamos una gota de aceite de inmersión y examinamos al microscopio
óptico con el objetivo de 100 x.
Los eritrocitos
se tiñen de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta.
Los neutrófilos
presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación
de un color violeta rojizo.
6. TINCIÓN DE
WRIGHT.
Metódica
Extracto de las
técnicas de tinción hematológica de la casa Panreac.
Fundamento
El colorante
utilizado es una solución de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al
75%) y azur B (del 10 al 25%) junto con otros derivados del alcohol metílico.
Dada la
presencia de metanol en la composición del colorante, no es necesario un paso
previo de fijación antes de la coloración.
Sólo si se van a
guardar las extensiones sin teñir de un día para otro precederemos a su
fijación para evitar el deterioro del frotis.
Material
necesario
·
Microscopio óptico.
·
Cristalizador.
·
Puentes de
tinción.
·
Pipetas Pasteur
con chupete.
·
Frasco lavador.
·
Guantes.
·
Tubos de ensayo.
Reactivos
·
Solución de
eosina-azul de metileno según Wright.
·
Solución tampón
pH 7,2.
·
Aceite de
inmersión.
Muestra
Sangre capilar
fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes más adecuados son la
heparina y el EDTA.
Técnica
·
Realizar un
frotis sanguíneo muy fino. Dejar secar al aire.
·
Sobre la
extensión colocada horizontalmente en el puente de tinción verter 1 ml de
eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solución tampón
pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.
·
Inmediatamente
antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de
metileno con 0,5 ml de solución tampón pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con
esta dilución la extensión. Teñimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del
grifo. Volvemos a lavar con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y
secar en posición vertical.
Lectura de
resultados
Depositamos una
gota de aceite de inmersión y observamos con el objetivo de 100 x.
Las células se
observan coloreadas de la misma manera que con la tinción de Giemsa.
7. TINCIÓN
PANÓPTICO RÁPIDO.
Metódica
Extracto de la
técnica Panóptico rápido de la casa QCA.
Fundamento
Este método de
tinción diferencial es un sistema que aúna la policromía y la calidad que
proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de
ejecución (15 segundos solamente).
Frente a las
técnicas de tinción descritas anteriormente, donde el colorante se extendía
sobre el frotis, ésta presenta la peculiaridad de ser un método de inmersión,
donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo
determinado.
Material
necesario
·
Cubetas de
Wertheim o similares.
·
Cestillo para
portas.
·
Frasco lavador.
Reactivos
·
Solución nº 1:
Solución alcohólica de triarilmetano.
·
Solución nº 2:
Solución tamponada de xanteno.
·
Solución nº 3:
Solución tamponada de tiazina.
·
Agua destilada.
Muestra
Frotis sanguíneo
preparado recientemente y que se ha dejado secar al aire.
Técnica
En tres cubetas
de Wertheim o similares se disponen los colorantes solución nº 1, nº 2 y nº 3.
·
Colocamos los
frotis en el cestillo para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solución
nº 1 durante 1 segundo. Repetimos la inmersión cuatro veces (en total 5
segundos). Dejamos escurrir.
·
Sumergimos a
continuación otras cinco veces, cada una de un segundo de duración, en la
cubeta con la solución nº 2. Dejamos escurrir.
·
Finalmente,
sumergimos otras cinco veces de un segundo cada una en la cubeta con la
solución nº 3. Lavamos con agua destilada y dejamos secar.
Lectura de
resultados
Depositamos una
gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100
x.
Las coloraciones
obtenidas en las células sanguíneas son similares a las de la tinción de Wright
y Giemsa. Sin embargo, podemos variar la intensidad de la tinción modificando
el número de inmersiones en los colorantes nº 2 y nº 3, según se desee destacar
las tonalidades rosas o las azules.
Notas sobre el
método
·
Las cubetas con
las soluciones colorantes, especialmente la del nº 1, deberán guardarse siempre
bien tapadas, con el fin de evitar una evaporación excesiva que podría inducir
a desviaciones de color respecto a las tinciones habituales.
·
Antes de agotar
el contenido de una cubeta, debemos ir adicionando una nueva cantidad de
solución colorante para mantener, día a día, un nivel apropiado del mismo. De
vez en cuando se debe renovar todo el contenido de la cubeta.
·
En aquellos laboratorios
con pequeño número de fórmulas hemáticas, las cubetas de Wertheim pueden ser
sustituidas ventajosamente por pequeños frascos de cristal con tapón a rosca.
